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    液相基础知识

    时间:2017-05-17来源:沙巴足球直播 本文已影响

    篇一:液相色谱仪操作基本知识

    液相色谱仪操作基本知识

    一.熟练掌握HP1100液相色谱仪和韩国洋林液相色谱仪操作规程

    二.色谱柱使用注意事项:

    1.流动相应与色谱柱相匹配

    2.不能超过最高使用压力

    3.不能超过PH值范围

    4.不能反向使用

    5.尽量使用预柱

    6.用后认真冲洗,保存在甲醇或乙腈中

    三.流动相应满足下列要求:

    1.小分子量或沸点在100°C以下的流动相较好

    2.不应与固定相发生反应

    3.有利于保持色谱柱的稳定性

    4.不得含有易于沉淀在柱子上的杂质

    5.必须与检测器相适应

    6.流动相中含有氯化物或生成氯化物者,对不锈钢有腐蚀作用

    7.对样品要有合适的溶解度,粘度低

    四.影响液相色谱分离的因素

    1.固定相的种类、规格、处理方法

    2.色谱柱的长度、内径

    3.流动相的种类、比例、流速

    4.PH值的大小

    5.柱温

    6.仪器的稳定性

    五.在给定色谱条件下,哪些是可变的,哪些是不可变的

    可以改变的:

    1. 色谱柱的品牌

    2. 色谱柱的柱长、内径、填料规格

    3. 流动相的比例、流速

    4. 柱温

    5. 进样量

    不可变得:

    1.填料的种类

    2.流动相的组成

    3.检测器的波长

    六.反相色谱中,常用的强冲洗组分有哪些〉?改变它们对分离有什么影响?

    常用的强冲洗组份由甲醇、乙腈、四氢呋喃。改变它们可以改变分离的选择性,改变分析时间。

    七.液相色谱仪要保持泵的良好性能,必须做到:

    1.用高质量的试剂和HPLC级溶剂

    2.流动相和溶剂必须过滤

    3.不让缓冲液滞留在泵和管道中

    4.不让水和腐蚀性溶剂滞留泵和管道中

    5.流速应逐渐调到设定值,尽量避免流速突然大范围变动

    6.定期更换密封圈

    7.使用泵头清洗装置

    八.手动进样注意事项

    1.微量注射器中不能有气泡残留

    2.注射器取样量应不少于定量环容积的五倍

    3.用注射器定量进样,进样体积不能大于环容积的50%

    4.进样阀在LOAD和INJECT之间不能停留

    5.手动进样器用后应清洗

    九.根据流动相和固定相的极性,液相色谱可分为正相色谱(固定相极性大于流

    动相)和反相色谱(流动相极性大于固定相极性)

    十.引起柱压较高的因素

    1.预柱堵塞

    2.HP1100液相色谱仪中PURGE阀中过滤芯堵塞

    3.流动相的两相比例越接近,柱压越高

    4.仪器管道堵塞

    5.色谱柱堵塞

    十一.色谱柱的洗涤与保存

    1.流动相中有酸、盐时,用20倍柱体积的水洗涤(4.6*150mm,柱体积为

    2.5ml;4.6*250mm,柱体积为4.2ml);如果流动相中有离子对试剂、胺改良剂等冲洗时间应适当延长

    2.用20倍柱体积的流动相中所使用的强冲洗组份冲洗

    3.长时间不用,应把色谱柱拆下,两端用端帽封禁,防止柱床干涸

    十二.普通的键合硅胶柱,PH值范围一般不超2~8,不同厂家稍有不同。色谱柱使用之前应仔细阅读说明书。注意其PH值适用范围和最高使用压力

    十三.流动相和样品用0.45um滤膜过滤后,用对光检查一下瓶内是否有异物,如有异物应重新过滤

    十四.储液瓶应经常刷洗,防止细菌生成;HP1100液相色谱仪泵头清洗液,只要开泵就需打开;韩国洋林液相泵头清洗液应每天更换(这些清洗泵头的水必须用0.45um滤膜滤过)

    十五.微量注射器用后应认真清洗,防止针污染,针头氧化。

    十六.色谱柱评价|:不同厂家可能用不同的化合物测定柱效。我们用的是尿嘧啶、萘、芴。

    篇二:最全的高效液相知识

    最全的高效液相知识 2011-09-24 15:06 | (分类:专业)

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    (一)、开机:

    1、打开计算机,进入Windows NT (或Windows 2000)画面,并运行Bootp Server程序。

    2、打开 1100 LC 各模块电源。

    3、待各模块自检完成后,双击Instrument 1 Online图标,化学工作站自动与1100LC通讯,进入的工作站画面。

    4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”,“Show status toolbar”,“System diagram”,”Sampling diagram”,使其命令前有“√”标志,来调用所需的界面。

    5、把流动相放入溶剂瓶中。

    6、打开Purge阀。

    7、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Setup pump选项,进入泵编辑画面。 8 、设Flow:5ml/min,单击OK。

    9、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Pump control选项,选中On,单击OK,则系统开始Purge,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止,切换通道继续Purge,直到所有要用通道无气泡为止。

    10、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Pump Control选项,选中Off,单击Ok关泵, 关闭Purge valve。

    11、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Setup pump选项,进入Pump编辑画面,设Flow:1.0ml/min。

    12、单击泵下面的瓶图标,输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。

    (二)数据采集方法编辑:

    1、开始编辑完整方法:

    ●从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项,如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项,单击Ok,进入下一画面。

    2、方法信息:

    ●在“Method Comments”中加入方法的信息(如:方法的用途等)。

    ●单击Ok 进入下一画面。

    3、泵参数设定:(以二元泵为例)

    ●在“Flow”处输入流量,如1ml/min,在“Solvent B”处输入70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。● 单击Ok进入下一画面。

    4、自动进样器参数设定:

    ●选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为6号。“Standard Injection”----只能输入进样体积,此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗瓶位置,此方式针从样品瓶抽完样品后,会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---可以点击Edit 键进行进样程序编辑。

    ●点击Ok进入下一画面。

    5、柱温箱参数设定:

    ●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>” 键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱的温度左右一致。

    ●点击ok进入下一画面。

    6、VWD检测器参数设定:

    ●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间, 如>0.1min (2s)。

    ●在Timetable 中可以“Insert”一行,输入随时间切换的波长,如1min ,波长=300nm。点击ok进入下一画面。

    7、DAD检测器参数设定:

    ●检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;

    ●检测波长:一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW: 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长:一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW:至少要与样品信号的带宽相等,许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width(Response time):其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit—狭缝窄,光谱分辨率高;宽时,噪音低。同时可以输入采集光谱方式,步长,范围,阈值。选中所用的灯。

    ●点击Ok进入下一画面。

    8、RID检测器参数设定:

    ●色谱条件:

    进样体积: 20ul 。光学单元温度: Off 。

    极性: 正 。 峰宽(响应时间) : 4s 。

    ●“Optical Unit Temperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”---大多数分析设为4S,只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”---在不进行分析时可以让流动相循环,节省流动相,检测器连续运行,可随时投入使用。

    ●点击RID图标,选择RID Control :Heater 设为On,若要循环流动相,必须将“Recycling Valve”设为ON。手动purge 参比池,将其设为On,并输入Purge 时间。

    9、FLD检测器参数设定:

    色谱条件:

    ●样品:P/N 01018-68704 用甲醇稀释为1:10。

    ● 进样体积:5ul。

    ● 柱温箱: 30℃ 。EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。

    ● 响应时间=4s. 停止时间: 出峰完毕。

    ● Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。

    ● Emission: 发射波长: 280-900nm, 步长为1nm,或Zero Order。

    ● PMT: 大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。● “Peak width”:大多数应用设为4s,只有快速分析采用小的设定值。

    ● Multi Ex : 多波长及光谱(激发)。

    ● Multi Em:多波长及光谱(发射)。

    ● 同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。

    10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”,单击Ok。

    11、单击“Method”菜单,选中“Save method as”,输入一方法名,如“test”,单击Ok。

    12、从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows 2)。

    13、从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项,如上图所示,输入操作者名称,在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。

    区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。Prefix—在Prefix 框中输入前缀,在Counter 框中输入计数器的起始位,仪器会自动命名,如vwd0001,vwd0002……。

    14、从Instrument 菜单选择System on。

    15、等仪器Ready,基线平稳,从Method菜单中选择“Run method”,进样。

    (三)、数据分析方法编辑:

    1、从“View”菜单中,单击“Data analysis”进入数据分析画面。

    2、从“File”菜单选择“Load signal”,选中您的数据文件名,如下图所示。单击Ok。

    3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项,。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时间,单击ok,或选择”Use Ranges” 调整。反复进行,直到图的比例合适为止。

    4、积分:

    (1)、从“Integration”中选择 “Auto integrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项,选择合适的Slope sensitivity,Peak width,Area reject,Height reject。

    (2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项, 则数据被积分。

    (3)、如积分结果不理想,则修改相应的积分参数,直到满意为止。

    (4)、单击左边“√”图标,将积分参数存入方法。

    5、打印报告:

    (1)、从“Report”菜单中选择“Specify report”选项,进入如上画面。

    (2)、单击“Quantitative Results”框中Calculate右侧的黑三角,选中Percent(面积百分比),其它选项不变。

    (3)、单击Ok.

    (4)、从“Report”菜单中选择“Print report”,则报告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则单击Report 底部的“Print”钮。

    (四)、关机:

    ● 关机前,用 100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如ACN),然后关泵,(适于反相色谱柱)。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

    ● 退出化学工作站,及其它窗口,关闭计算机(用shut down关)。

    关掉Agilent 1100电源开关。

    Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项:

    1、色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死(如ACN适于反相色谱柱,正相色谱柱用相应的有机相)

    2、对于手动进样器,当使用缓冲溶液时,要用水冲洗进样口,同时搬动进样阀数次,每次数毫升。

    3、流动相使用前必须过滤,不要使用多日存放的蒸馏水(易长菌)。

    4、带seal-wash的 1100,要配制90%水+10%异丙醇,以每分2—3滴的速度虹吸排出,溶剂不能干涸。

    5、其它主意事项见说明书,或由现场工程师介绍。

    维护知识问答

    1、为什么溶剂和样品要过滤?

    溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保护作用,消除由于污染对分析结果的影响。

    色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

    仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

    样品过滤头的类型:

    30mm内径:适用于大进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。

    13mm内径:适用于范围广的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。

    3mm内径:适用于小进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。 滤膜类型:

    聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐,并无任何可溶物。

    醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶液,推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。

    再生纤维素滤膜:具有蛋白吸收低,同样适用水溶性样品和有机溶剂。

    2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项?

    HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.

    清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下,不能干涸。

    3、为什么Agilent 1100LC的流动相管路非常细?

    在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响,由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级,液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此,样品进入色谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、连接管、检测器)中,样品分子的扩散和滞留,都会引起色谱峰的展宽,而使柱效降低。为使柱外效应减之最小,获得理想的分析结果,Agilent 1100LC 使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。

    毛细管线分类:0.17mm内径 ------绿色 ;0.12mm内径-------红色。

    PEEK 管线:内径 -----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。

    毛细管线优点: 柔韧性好.

    ***Agilent 公司同时备有1/16in 的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户 ,优点是刚性好,但柔韧性差一些。

    4、流动相使用前为什么要脱气?

    流动相使用前必须进行脱气处理 ,以除去其中溶解的气体(如O2),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度下降,甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,可能会造成荧光猝灭。

    常用的脱气方法比较:

    氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低,连续吹氦脱气,效果较好,但成本高。 加热回流法:效果较好,但操作复杂,且有毒性挥发污染。

    抽真空脱气法:易抽走有机相。

    超声脱气法:流动相放在超声波容器中,用超声波振荡10-15min,此法效果最差。

    在线真空脱气法:Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术, 在线脱气,智能控制,无需额外操作,成本低,脱气效果明显优

    液相基础知识

    于以上几种方法,并适用于多元溶剂体系。

    5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞,以及堵塞后的处理?

    溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器,从而影响泵的运行,尤其水溶液或磷酸盐缓冲液(PH=4—7)。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。 A:请严格执行溶剂过滤。

    B:请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液

    C:如果应用许可,可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.

    D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。

    E:避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下,尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。 堵塞后的处理法方法:将过滤头从组件中取下,在浓硝酸(35%)中浸泡1h,然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。

    6、Agilent 1100LC泵如何维护?

    Agilent 1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相,及时合理的维护非常重要。

    A:流动相使用前请必须脱气、过滤。

    B:使用缓冲盐时,要加在线Seal-wash选项。

    C:关机前,用 100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如甲醇),然后关泵,(适于反相色谱柱)。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

    D:及时更换Purge Valve内的过滤芯。(当打开Purge Valve时,压力高于10bar,表明过滤芯已堵)。E:使用合适的密封圈。

    7、如何选择合适的泵头活塞密封圈?

    泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用,但使用正相溶剂(如正己烷),不适合使用标准活塞密封圈,特别是长时间使用时,需更换另一种不同的密封圈,我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。(p/n0905-1420 2/pk)

    ***注意:聚四氟乙烯密封圈的压力范围为:0—200bar;建议在泵的压力限制中,将最大压力设为200bar。

    8、使用梯度比例发时要注意那些事项?

    当盐溶液与有机溶剂溶液混合时,盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶,而不会出现沉淀。

    篇三:高效液相色谱法知识汇总大全集

    高效液相色谱法知识汇总大全集(最新最值得收藏的资料整理)

    HPLC应用

    一、样品测定

    1.流动相比例调整:由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度,因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相(按经验,主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜)。所以建议第一次检验时请少配流动相,以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到,请注意充分平衡柱。

    2.样品配制:①溶剂;②容器:塑料容器常含有高沸点的增塑剂,可能释放到样品液中造成污染,而且还会吸留某些药物,引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药物的定量回收,因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。

    3.记录时间:第一次测定时,应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针,并尽量收集较长时间的图谱(如30分钟以上),以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来,确定是否会影响主峰的测定。

    4.进样量:药品标准中常标明注入10ml,而目前多数HPLC系统采用定量环(10ml、20ml和50ml),因此应注意进样量是否一致。(可改变样液浓度)

    5.计算:由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同,有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示,检验时请注意。

    6.仪器的使用:

    ①流动相滤过后,注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。

    ②柱在线时,增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行,一般不超过1ml/min,反之亦然。否则会使柱床下塌,叉峰。柱不线时,要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去(或下来),勿急升(降),以免泵损坏。

    ③安装柱时,请注意流向,接口处不要留有空隙。

    ④样品液请注意滤过(注射液可不需滤过)后进样,注意样品溶剂的挥发性。

    ⑤测定完毕请用水冲柱1小时,甲醇30分钟。如果第二天仍使用,可用水以低流速(0.1~0.3ml/min)冲洗过夜(注意水要够量),不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是:对于含碳量高、封尾充分的柱,应先用含5~10%甲醇的水冲洗,再用甲醇冲洗。

    ⑥冲水的同时请用水充分冲洗柱头(如有自动清洗装置系统,则应更换水)。

    二、方法研究

    1.波长选择:首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱,以选择合适的测量波长,如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值,如吸收度小于0.5时,HPLC测定的面积将会很小。

    2.流动相选择:尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。

    附件:高效液相色谱法(HPLC)复核细则

    一、对起草单位的要求:

    1.HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时,需提供建立HPLC法的依据及参考文献。

    2.应对建立的方法进行论证,按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。

    3.建立方法时,应考虑下列事项:

    ①首选填料为十八烷基键合硅胶,并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验,其中一根为国产柱。

    ②流动相首选甲醇-水系统,应尽可能少用含有缓冲液的流动相,如为碱性药物,流动相的pH值应为7~8;如为酸性药物,流动相的pH值应为3~4。

    ③尽可能选用流动相作为溶剂,如未能选用,应说明原因。

    ④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品,应与待测物质化学结构相似,理化性质接近,峰的响应值相当,以及分离度应大于1.5,另应考虑对照品的来源问题。 ⑤检测器首选UV检测器。

    4.采用HPLC法进行有关物质检查时,如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大,应首选自身对照法,而不宜选用面积归一化法。

    5.HPLC法用于原料药的含量测定。如以内标法测定含量,应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质;如以外标法测定含量,对照品与供试品应各取样2份,对照品溶液各进样3次,供试品溶液各进样2次,计算相对标准差(RSD应不得大于l.5%)。

    二、对复核单位的要求:http://hplc2.blog.163.com/blog

    1.按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。

    2.当HPLC法用于有关物质的检查时,应进行最低捡出量试验。

    3.应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性,并作出评价。

    4、流动相使用前为什么要脱气?

    流动相使用前必须进行脱气处理 ,以除去其中溶解的气体(如O2),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度下降,甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,可能会造成荧光猝灭。

    常用的脱气方法比较:

    氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低,连续吹氦脱气,效果较好,但成本高。 加热回流法:效果较好,但操作复杂,且有毒性挥发污染。

    抽真空脱气法:易抽走有机相。

    超声脱气法:流动相放在超声波容器中,用超声波振荡10-15min,此法效果最差。

    在线真空脱气法:Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术, 在线脱气,智能控制,无需额外操作,成本低,脱气效果明显优于以上几种方法,并适用于多元溶剂体系。

    1、为什么溶剂和样品要过滤?

    溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保护作用,消除由于污染对分析结果的影响。

    色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

    仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

    样品过滤头的类型:

    30mm内径:适用于大进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。

    13mm内径:适用于范围广的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。

    3mm内径:适用于小进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。

    滤膜类型:

    聚四氟乙烯滤膜:适用于所有溶剂,酸和盐,并无任何可溶物。

    醋酸纤维滤膜:不适用于有机溶剂,特别适用于水基溶液,推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜:适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。

    再生纤维素滤膜:具有蛋白吸收低,同样适用水溶性样品和有机溶剂。

    2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项?

    HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.

    清洗液配制: 90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下,不能干涸。

    高效液相色谱级乙腈的质量评价

    信息来源:液色迷人

    摘要: 高效液相色谱(HPLC)分析中,流动相溶剂的纯度和质量对分析结果和仪器本身都有重要影响。溶剂中的各种痕量杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰,进而影响定性定量分析结果,而且可能会污染分离柱和堵塞系统,造成仪器出现故障。了解HPLC溶剂规格和相关的测试方法,可以帮助HPLC 用户评价和筛选HPLC溶剂,减少溶剂杂质对应用造成的负面影响。本文介绍了基于紫外(UV)吸收和HPLC梯度确定HPLC级乙腈纯度和质量的两种规范方法及其对HPLC分析的意义,并探讨了这两种方法的实际应用。

    乙腈区别于其他HPLC溶剂的独特性质(中等洗脱能力、强溶解能力、能够得到明确的色谱峰、低粘度、相对于醇类和酯类有较低的UV吸收)[1],使其成为 最常用的有机流动相组分。乙腈一般是(由氨和丙烯)大规模生产丙烯腈的副产物。其中可能含有多种很少量的杂质,例如丙烯腈、α(β)-甲基丙烯腈、顺/反 式丁烯腈、乙醛、丙酮、甲醇、乙基氰化物、丙烯醛、烯丙醇、丙烯酸、恶唑和乙酸[2-4]。经过复杂的纯化过程,痕量的上述杂质可能仍然存在于HPLC级 乙腈中。其中一些杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰,进而影响定性定量分析,而且会污染分析柱、堵塞系统,导致仪器出现故障。

    作为美国分析试剂标准测试方法的权威,美国化学学会(ACS)分析试剂委员会在《试剂化学品》(第9版)中明确定义了HPLC级乙腈的技术说明,包括通用 的说明和HPLC的适用说明。通用的说明包括气相色谱(GC)纯度、水、滴定酸或碱、以及挥发残留物。HPLC的适用说明包括UV吸收和HPLC空白梯度 洗脱基线[5]。

    本文详细介绍了乙腈的两种适用于HPLC的规范方法及其对HPLC应用的意义,并通过详尽的实验数据讨论了操作中的注意事项以及影响测试结果的因素。

    1 实验

    1.1 仪器

    本文中使用了两种HPLC系统,其特定条件介绍如下:Agilent 1100 HPLC系统由脱气机(G1379A)、四元泵(G1311A)、自动进样器(G1315A)和二极管阵列检测器(DAD)(G1315B) (Agilent Technologies, Wilmington, DE)组成,并用该系统获得图1和图2的结果。其他色谱图由Alliance 2695 HPLC系统和2996 光电二极管阵列(PDA)检测器(Waters, Milford, MA)获得。ZORBAX C18柱由Agilent提供;B&J C8柱从Honeywell Burdick & Jackson获得。

    UV光谱使用Cary 4000 UV-VIS 分光光度计(Varian, Palo Alto, CA)。参比池为1 cm石英池,样品池为1 cm或5 cm石英池。

    1.2 药品和试剂

    HPLC级乙腈来自Honeywell Burdick & Jackson 及其他HPLC溶剂供应商。高纯水由

    Milli-Q超纯水系统(Millipore, Bedford, MA)和Honeywell Burdick & Jackson供应。乙酸(AR)由Sigma(St. Louis, MO)提供。

    2 结果和讨论

    2.1 HPLC级乙腈UV吸收规范的意义

    UV吸收背景对HPLC乙腈的关键性源于两个原因。首先,大部分有机杂质都会产生UV吸收。乙腈的UV吸收越小意味着其中杂质含量越少。第二,HPLC仪器最常用的检测模式就是UV检测。因此乙腈的UV吸收越小,色谱的基线背景越低;从而灵敏度越高,检测限越低。

    图3是来自不同供应商的HPLC级乙腈的UV光谱,尤其是在短波长范围(300~190 nm)并不相同。这可能是由于乙腈中难以去除的杂质因各溶剂供应商使用的纯化技术不同而不同。鉴于使用UV检测器的HPLC分析中大部分分析物在300 nm以下检测,因此大部分溶剂供应商在上述波长范围内设立UV吸收规范。

    2.2 影响UV吸收测量值的因素

    在测试实验中,很多因素会影响UV吸收的测量值:

    (1)光路距离(比色皿长)。在0.2~0.8 AU范围内,吸光率(A)的测量值误差最小,否则吸光率的测量误差会相对大些。如使用1 cm比色皿,即使在250~210 nm的短波长范围内,乙腈的吸光率也远小于0.2 AU,因此可能产生很大的误差。根据比尔定律,溶剂的吸光率和样品的光路距离成正比,因此增加样品池长度会使溶剂吸光率增加,使其值进入0.2~0.8 AU范围内,从而减小测量误差。使用5 cm比色皿,在400~190 nm扫描范围内得到不同乙腈样品的UV光谱(如图4所示)。从图4中曲线可以发现,使用5 cm比色皿可使乙腈在低波长的大部分UV吸光率进入0.2~0.8 AU范围,从而显示出数据的准确度更高。而且,不同乙腈样品的UV吸光率的差别与使用1 cm比色皿时相比更明显。鉴于这一点,Honeywell Burdick & Jackson等一些生产商使用1 cm和5 cm两种比色皿建立UV吸收规范。

    (2)仪器参数。由于乙腈的吸光率非常低,仪器参数的设定要保证最佳的灵敏度和准确度。双光路模式可以克服单光路模式中光源能量随时间变化的缺点,并且可以更方便地扫描UV全波长范围。使用分光光度计的基线校正功能,可以去除由光源、检测器和样品池等引入的仪器变化[6]。由于仪器噪声随着扫描速度的提高 而增大,因此推荐使用最大扫描速度的一半。

    (3)参比物。用于溶剂UV吸收测定的参比物有两种可能。《试剂化学品》(第9版)使用水作为参比;而《中国药典》使用空气作为参比。使用空气作为参比时测定的乙腈UV吸收值低于使用水作为参比时测定的值,而且在400~250 nm波长的范围内通常为负值。这是由于空气中氧和二氧化碳的贡献使其UV吸收强于水。如图5中所示,由于参比不同造成的UV吸收有显著不同,高达 0.03 AU,所以当我们阅读供应商提供的分析报告证书时需要了解究竟是使用水还是使用空气作为参比。

    推荐使用新鲜的HPLC级瓶装水或者实验室超纯水系统制得的超纯水作为参比物。值得注意的是,实验室超纯水系统制得的新鲜水常常含有大量的气泡,这些气泡需要在实验前去除,否则会影响数据的准确度。

    (4)氮气喷雾。为了延长溶剂的保存时间,一些HPLC溶剂供应商将惰性氮气充入溶剂。作者研究了氮气对乙腈UV吸收的影响(图6)。结果发现经过氮气喷 雾,乙腈在250~200 nm范围内的UV吸收显著降低。200 nm处的吸光率为0.012,是氮气喷射前的四分之一。

    其原因可能是氮气在乙腈中的溶解度远小于氧气和二氧化碳。氮气喷雾减少了氧气和二氧化碳对乙腈UV 吸收的贡献。(注意:也可能是由于氧气和溶剂形成了电荷传递复合物导致了UV吸收。)

    (5)溶剂的挥发性。由于乙腈是一种挥发性溶剂,如果样品池和参比池在测试过程中是敞开的,那么样品池中的乙腈蒸汽可能会进入样品室或参比池,结果造成吸光率读数偏低。因此,推荐在实验中用聚四氟乙烯(PTFE)盖子将这两个池都盖住。

    2.3 HPLC级乙腈空白梯度洗脱规范的意义

    如果溶剂中的杂质水平低于1 ppm,简单的UV光谱通常检测不到其存在[1]。然而,这些痕量杂质可能在有机相和水相比例较低时在柱上富集并保留,然后当梯度过程中流动相洗脱能力增强时被洗脱下来,从而形成鬼峰[7]。因此,HPLC空白梯度洗脱基线上的鬼峰高低,是评价HPLC级乙腈质量的关键规范方法。它清楚地表明了乙腈中是否 含有影响梯度洗脱模式下HPLC分析的痕量的杂质。

    《试剂化学品》(第9版)明确规定214 nm处HPLC空白梯度洗脱基线的最大峰高应低于5 mAU。具体的测定方法如下:C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm);梯度:0 min,80% 水(溶剂A),20% 乙腈(溶剂B),保持30 min;在50 min时达到 100% B,保持10 min;流速2 mL/min。样品运行3次,并去掉第1次运行的结果[5]。图7比较了B&J ACS/HPLC和几种国内色谱级乙腈样品的ACS空白梯度洗脱基线。结果表明,一些本地产色谱级乙腈样品在254 nm时会产生高达20 mAU的鬼峰。这说明即使在254 nm处,这些国产试剂也可能在HPLC常规分析中产生干扰。

    在HPLC的一些实际应用中,往往需要在更低波长处使用梯度洗脱模式以实现高灵敏度的HPLC分析,因此对乙腈的HPLC空白梯度洗脱规范提出了更高的要 求。为了满足高灵敏HPLC应用的要求,一些溶剂供应商也生产梯度级HPLC乙腈。这种乙腈不同于用于等度洗脱HPLC分析的乙腈,它们可以满足更严格的 梯度洗脱规范。例如,Honeywell Burdick & Jackson的空白梯度洗脱基线规格为:254 nm时低于1 mAU,215 nm时低于5 mAU。图1中,在215 nm下,不同供应商的梯度级乙腈的梯度洗脱基线不同,说明它们用于低波长梯度洗脱模式痕量HPLC分析的质量不同。

    2.4 影响空白梯度洗脱基线测定的因素

    由于操作和HPLC系统本身的复杂性,系统中的任何部分都可能成为梯度洗脱基线鬼峰的来源,因此在实验过程中应十分注意降低HPLC系统和水相的干扰。

    (1)HPLC系统污染和流动相添加剂的影响。梯度洗脱过程中,任何有UV吸收的杂质都可能产生鬼峰。除了HPLC进样系统和色谱柱的污染,样品溶剂和流 动相的不匹配也会产生鬼峰。图8为当100%乙腈样品进入系统中,乙腈和水梯度运行色谱图中开始处可能产生正或负的鬼峰。因此进行空白梯度洗脱基线测定 时,为了去除可能来自进样系统的干扰而不予以进样。测试前色谱柱应彻底洗净,或者使用一根专门用来做这个实验的色谱柱来避免来源于色谱柱的交叉污染。

    HPLC分析的实际应用中,常向流动相中加入一些添加剂来改善分离和峰形。然而,这些添加剂也可能成为梯度洗脱基线鬼峰的来源。图9中可见,水相中加入乙酸会导致梯度洗脱基线中有鬼峰。因此,乙腈空白梯度洗脱基线测定操作中,只用水和乙腈作为流动相而不加添加剂。

    (2)HPLC系统中气泡的影响。溶剂中的气泡经过HPLC系统也可能产生鬼峰(图10)。

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